先有雞還是先有蛋？我回答不了這個(gè)古老的問題，但我能肯定的告訴你，第一個(gè)成功冷凍保存的物種是家禽，不是卵子，而是精子。在生殖生物學(xué)中是個(gè)非凡而又經(jīng)典的故事，但卻不是例外。
二戰(zhàn)剛結(jié)束后不久，雄心勃勃的英國年輕科學(xué)家克里斯托弗·波爾奇(Christopher Polge)就開始在倫敦從事家禽精子的冷凍保存工作。根據(jù)之前的一些研究，他們在培養(yǎng)液中加入不同濃度的果糖，果糖的加入能提高形態(tài)學(xué)存活率，但看似有活力的精子卻無法進(jìn)入卵子，更不要提受精了。于是克里斯托弗去度假了。
當(dāng)他度假回來，他又重新開始工作，拿著架子上之前的舊瓶子做了另一次嘗試。令他驚訝不已的是，情況有了好轉(zhuǎn)！他很激動，但也很好奇為什么？
區(qū)別在哪里？他詢問周圍的每個(gè)人，并對瓶子里新的果糖溶液含量進(jìn)行比較，這一次的確是不同的，濃度、溶劑效應(yīng)、一切都不一樣。
最終真相大白，原來是在波爾奇教授度假時(shí)，他的一個(gè)同事在他的工作臺上進(jìn)行了一項(xiàng)完全不同的工作：對精子進(jìn)行微觀評估。這個(gè)舊瓶子原本是用來給載玻片準(zhǔn)備固定劑的，里面裝的不是果糖溶液，而是蛋清、甘油和一種酒精的混合物。
很快，人們發(fā)現(xiàn)甘油是一種極好的冷凍保護(hù)劑，已故的波爾奇教授用它來冷凍雞精子，然后冷凍牛精子，并且這兩個(gè)物種都產(chǎn)生了后代。這一發(fā)現(xiàn)催生了一個(gè)完整的產(chǎn)業(yè)——人工授精（AI），由此產(chǎn)生了數(shù)十億頭從冷凍精液中誕生的牛。在細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)中，甘油仍然是最常用的冷凍保護(hù)劑。幾十年后，它也成為家畜甚至人類胚胎傳統(tǒng)慢速冷凍試劑的主要成分。
這一切的發(fā)生都是因?yàn)橐粋€(gè)愚蠢的錯(cuò)誤。
我不能告訴你我的故事，是某個(gè)意外事件（停電，機(jī)器故障，時(shí)間安排不妥當(dāng)，在午夜懶惰地回到實(shí)驗(yàn)室，計(jì)算錯(cuò)誤等等）導(dǎo)致了一個(gè)具體問題的突破。我也不能告訴你，這種事發(fā)生過很多次。我不能告訴你，因?yàn)槟銜f我是科學(xué)界的憨豆先生。
但是，對于波奇教授來說，結(jié)果才是最重要的部分，而不是故事本身。因此，請正視你的錯(cuò)誤，檢查受盡你折磨的卵母細(xì)胞或胚胎，看看之后會發(fā)生什么。也許會有更好的結(jié)果，也許會有一個(gè)突破，也許某個(gè)糟糕的實(shí)驗(yàn)將決定你的整個(gè)未來！
關(guān)于低溫冷凍保存的試劑成分有幾個(gè)基本組成部分，包括：
1. 基礎(chǔ)液：由幾種（5-7種）或多種（20-40種）成分構(gòu)成的生理鹽溶液，包含了能量來源，維生素等，通常用于組織培養(yǎng)和胚胎學(xué)中；
2. 緩沖成分：維持在空氣中穩(wěn)定的生理pH；
3. 大分子物質(zhì)：有機(jī)或無機(jī)化合物，其組成有明確的、半確定的和未確定的成分；
4. 冷凍保護(hù)劑。
不同基礎(chǔ)液對玻璃化結(jié)果影響的比較研究很少，大多數(shù)科學(xué)家認(rèn)為它們只是這個(gè)過程中的次要部分，就像電影中的配角，或者賽車的輪胎。然而在實(shí)際情況中，輪胎在某些情況下可能會起到關(guān)鍵的作用，基礎(chǔ)液的作用也不應(yīng)該被低估。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，使用簡單磷酸鹽緩沖溶液（PBS）就可以成功地玻璃化凍存牛胚胎。然而大多數(shù)公司為他們的玻璃化產(chǎn)品提供了更復(fù)雜的基礎(chǔ)液。這些試劑通常是培養(yǎng)液的類似物，只是碳酸氫鹽緩沖成分被另一個(gè)不需二氧化碳的緩沖成分代替了（見后文）。
由于胚胎培養(yǎng)液在90年代末至21世紀(jì)初得到了極大的簡化，所以這些基礎(chǔ)液成分也不復(fù)雜，特別是如果我們將它們與80年代第一代胚胎培養(yǎng)基或現(xiàn)在普遍用于體細(xì)胞/組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行比較。通常情況下，胚胎并不需要如此復(fù)雜的溶液；在胚胎植入之前，它們生活在輸卵管中，此時(shí)并不是絕對地在人體內(nèi)部，而是通向外部世界的一個(gè)開放通道，在圍繞胚胎的分泌溶液中有更簡單的成分。很明顯，適合胚胎培養(yǎng)的也應(yīng)有利于玻璃化。
又或者不是？我們的“邏輯”理論并不能總適用于生物學(xué)過程。
家畜胚胎學(xué)家在有著更多的實(shí)驗(yàn)自由。而且，研究人類細(xì)胞玻璃化的先驅(qū)們在關(guān)于基本問題的有很多有價(jià)值的信息，這些信息在今天看來已經(jīng)被遺忘了。
關(guān)于基礎(chǔ)液，我們從“保守派”經(jīng)驗(yàn)開始，使用一種高度復(fù)雜的介質(zhì)，稱為199組織培養(yǎng)基（TCM 199）。然后，我們將其與組成更加簡單的新一代基礎(chǔ)液進(jìn)行了比較，兩者之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別。所以我們遵從了時(shí)間這個(gè)詞，開始使用新的、更簡單的基礎(chǔ)液，我們按照使用指導(dǎo)將這些新的基礎(chǔ)液在4?的條件下存儲了一個(gè)月、兩個(gè)月……然后存活率會開始下降，并在基礎(chǔ)液過期日左右變得更糟。這是我們在使用TCM-199時(shí)從未遇到過的情況。
這一發(fā)現(xiàn)從未發(fā)表過，只是在學(xué)術(shù)會議的晚宴上討論過。隨著同樣的結(jié)果出現(xiàn)在美國、澳大利亞、歐洲，我們慢慢用回了TCM-199…
相同的情況也發(fā)生在原來的Hepes緩沖液上。許多公司提供了替代方案，其中最受歡迎的是MOPS。然而, 除Hepes緩沖的TCM-199外，任何成分在儲存數(shù)月后都可能產(chǎn)生一些的負(fù)面影響，這些影響也許只有在到期日前后，但這類產(chǎn)品的保質(zhì)期都不會太長。相比之下，Hepes緩沖的TCM-199在時(shí)間上會提供慷慨的援助，從而能長期保持一致性，它是可靠的。
在我的故鄉(xiāng)匈牙利有一句諺語：“所有吉卜賽人都稱贊自己的馬”。沒錯(cuò)，VitaVitro韋拓生物的冷凍液產(chǎn)品中基礎(chǔ)液為Hepes緩沖的TCM-199。
VitaVitro韋拓希望為基礎(chǔ)液提供最好的成分，而且我們也確實(shí)選擇了這個(gè)解決方案，因?yàn)槲覀兒臀覀冊谑澜绺鞯氐耐屡笥褌兌颊J(rèn)為它是最好的。