3. 大分子物質(zhì)在低溫保存時并不是必需的，但添加這些物質(zhì)是非?？扇〉摹Ｋ鼈兊淖饔煤茈y具體說明，一般來說，它們可以保護樣本并提高存活率和隨后的發(fā)育率。產(chǎn)生這種效果的一方面原因可能是滲透壓的貢獻，因為可以使用更低濃度的非滲透和滲透冷凍保護劑（見下文）；另外一方面的原因可能是溶液黏度的增加會減少操作過程中的機械損傷。大分子物質(zhì)可阻止卵母細胞和胚胎附著在塑料和玻璃皿表面，也可以通過簡單的覆蓋或特定的結合來保護細胞膜。

在胚胎學領域，有一項持續(xù)了50年的嘗試，即在所有過程中使用有著明確定義化學成分的的培養(yǎng)液，以增加一致性和減少污染的危險。盡管人們進行了多次嘗試， 可直到今天，這些努力大部分都還是失敗了。 其中被認為最有前景的是聚乙二醇（PEG），聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚蔗糖。然而，獨立的比較研究發(fā)現(xiàn)這些成分的效率都低于蛋白質(zhì)。

近年來，羥丙基甲基纖維素（HPMC）被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中。種材料是由纖維素經(jīng)過相當劇烈的化學改性而制成的，它既可用于醫(yī)療目的（包括局部眼部治療和藥物表面涂層），也可作為無麩質(zhì)面包的谷蛋白替代品。它不會被消化道吸收，因此被認為是無毒的。

然而，它可能在眼部治療時會引起過敏反應，也可能會引起腸胃不適，但這正是谷蛋白敏感的人希望消除的。盡管有一些支持性的論文，但是根據(jù)以下的原因，我們在HPMC的使用上仍需要一定的謹慎。

a: 玻璃化溶液的濃度相對較高；

b: 對玻璃化的樣本，尤其是復蘇后的樣本缺少保護機制；

c: 在體外沒有任何屏障（如腸壁）來保護卵母細胞和胚胎。

在體外受精培養(yǎng)基中最常見的大分子是從人血清或血漿中提取的蛋白質(zhì)。這一類的產(chǎn)品種類繁多，包括最常見的人血清白蛋白（HSA）、含球蛋白和脂蛋白的血清代物（SSS），以及來自世界各地不同生產(chǎn)商的類似添加劑。早些時候，人血清也在這個清單上，但因為毒性和潛在的污染問題，它就不再被使用了。在世界上許多國家，政府會通過法規(guī)來限制在生殖過程中使用這些添加劑。幸運的是，在人類細胞的玻璃化中，HSA的使用不受限制并且它是完全適合于玻璃化。

4. 抗凍蛋白很難分類。根據(jù)定義，它們既是大分子物質(zhì)又是冷凍保護劑。它們是生活在惡劣環(huán)境中的生物體的產(chǎn)物，因為這些生物體需要在零度以下的環(huán)境中長時間生存。這些蛋白在一定程度上可以阻止冰晶的形成。在幸運的情況下，與冰點有幾度溫差也足以保證生存。

為了把我們從分類的任務中解放出來，我不得不告訴你，分類沒什么必要，因為這些蛋白可能也是不需要的。在過去的30年里，這些抗凍蛋白的應用在發(fā)表了幾篇論文后反復出現(xiàn)和消失。也許它們在某些脊椎動物的未來超低溫保存中會有一些有限的作用，但在我們（對不起，是你）的生命和我們?nèi)祟愔惺遣惶赡艿摹?/p>

5. 冷凍保護劑是玻璃化溶液中最重要且?guī)缀醪豢苫蛉钡某煞?。對于雄性配子來說，這種 “幾乎” 是必需的，其結構極為緊湊、含水量低，為無冷凍保護劑的玻璃化提供了一定的機會。

然而，對于大而致密化的卵母細胞，以及從受精卵到孵化囊胚的所有階段的胚胎來說，冷凍保護劑是絕對需要的。

這些化學物質(zhì)可以是滲透性的，也可以是非滲透性的。

這不僅僅是一個（愚蠢的）“學術”詭辯，它還意味著一項不同的任務，盡管這項任務略有重疊。

非滲透性冷凍保護劑的作用是在降溫前通過逐步增加緩慢的壓榨作用，將水從胞質(zhì)中擠出，并使細胞在復蘇時不因滲透休克而漲破。他們實際上沒有更多的功能，只是壓縮和保持壓縮，唯一的額外要求是無毒。從這個角度來看，蔗糖和我們?nèi)粘Ｉ钪酗嬘玫目Х取⒉韬秃强蓸分凶詈唵蔚奶菦]有差別。所以，僅僅是普通的蔗糖，沒有別的了。

比較勢利的版本是海藻糖，然而它也只是另一種糖而已，沒有任何額外的好處，只是價格高得多。不管怎樣，有些人更喜歡阿斯頓·馬丁，而我開著一輛有20年歷史的豐田巡洋艦。

讓我們繼續(xù)冷凍保護劑這個話題，另一組冷凍保護劑也與汽車相關。

有機溶劑是極好的冷凍保護劑，包括傳奇的甘油。但是其他的，包括傳統(tǒng)的乙醇，也被成功地用于這一目的。（一些實驗室——包括世界著名的實驗室，對使用乙醇噴霧凈化表面非常偏執(zhí)。他們可能不知道胚胎可以忍受濃度高達10%的酒精長達幾分鐘，這種環(huán)境甚至可以刺激它們的發(fā)展。沒有人能在血液中酒精濃度達到這種濃度十分之一時存活）

但說到汽車，乙二醇（EG）是一種毒性較低、最有效、最可靠的玻璃化冷凍保護劑，也是汽車冷卻液最重要的組成部分。原理是一樣的，防止結冰。我們只是運氣好，解決辦法就在我們的車庫里。

可惜單獨使用乙二醇（EG）并不是最好的策略。所有可滲透的冷凍保護劑都有一定的毒性作用，但這種作用在不同的低溫保護劑之間是不同的。如果我們使用兩種冷凍保護劑，每一種的毒性均減半，冷凍保護效果保持不變甚至會提高。

無論如何，仍然有許多團體和生產(chǎn)商信任二甲基亞砜，并抵制一些生產(chǎn)商的廣告宣傳替代品（丙二醇）是“無毒的”——事實上，其毒性比二甲基亞砜高出一個數(shù)量級，更重要的是——效率更低。

是的，但是第二種可滲透的冷凍保護劑應該是什么呢？在這里，實驗室和生產(chǎn)商之間的爭論是激烈的，戰(zhàn)斗到第一滴血，甚至更進一步。其中有幾個候選，但兩個最具競爭力的是丙二醇和二甲基亞砜（DMSO）。

事實上，DMSO只是運氣不好。它是一種優(yōu)秀的冷凍保護劑，也是一種優(yōu)秀的溶劑，毒性比其它競爭對手都小。作為一種良好的溶劑，它被用于動物實驗中溶解可疑的致癌物質(zhì)。它的效果很好，但是由于效果太好了以至于降低了被測試的溶解物質(zhì)的致癌作用。所以他們停止使用它。

現(xiàn)在許多科學家只聽到了部分故事，并將DMSO與致癌聯(lián)系起來。這聽起來很像那個“卷入搶劫案”的人。是的，他參與了，他被搶劫了……

無論如何，仍然有許多團隊和生產(chǎn)商相信DMSO， 并抵制一些生產(chǎn)商把丙二醇作為“無毒”的廣告。事實上，丙二醇的毒性比DMSO大一個數(shù)量級，更重要的是，它的效率更低。

當我在丹麥做牛胚胎學家的時候，我有幸研究了成千上萬的卵母細胞和胚胎。我利用這個機會測試了這些冷凍保護劑的許多可能的組合。最后發(fā)現(xiàn)了EG和DMSO在稀釋的和濃縮的溶液中的最佳比例。

所以，我們有了這樣的組合:

HEPES緩沖的TCM

人血清白蛋白

蔗糖

二甲基亞砜

乙二醇

當然，還有OPS敞開式?；瘍龃婀?/p>

拓展閱讀：

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