如上期博客中提到，早期玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)是在傳統(tǒng)低溫貯存容器中進(jìn)行的，如0.25ml塑料精液麥管或凍存管。這些工具并非為這個(gè)目的而設(shè)計(jì)，它們的管壁較厚，所需液量較大（麥管需5-7μl；凍存管需10μl以上）。因此，理論上可實(shí)現(xiàn)的降溫和復(fù)溫速率非常有限（麥管大約在2000℃/min；凍存管的速率更低，所幸很快就被淘汰）。為了避免麥管的崩裂或爆炸，我們?cè)诮禍睾蛷?fù)溫時(shí)采用兩步法，然而這些操作勢(shì)必會(huì)增加操作的不一致性。此外，這些大體積液體在極端壓力變化下的不均勻凝固導(dǎo)致了玻璃化的冷凍液開(kāi)裂和內(nèi)部細(xì)胞的破裂。所以，傳統(tǒng)冷凍的低效性并沒(méi)有被消除，反而是大部分的問(wèn)題沒(méi)解決的情況下又增加了更多的障礙。毫無(wú)疑問(wèn)，我們需要新的載體。

多虧哺乳動(dòng)物胚胎學(xué)家驚人的“創(chuàng)造力”，十多年來(lái)沒(méi)有發(fā)生任何進(jìn)展，幾乎所有的“專(zhuān)家”都接受了這些限制和缺陷。好吧，我不得不承認(rèn)——在這漫長(zhǎng)的七年里，我在這種無(wú)能為力中也扮演了重要的角色。

當(dāng)然在這期間也有過(guò)一些初步的嘗試，例如在無(wú)任何載體的情況下直接將胚胎滴入液氮中（Lauda and Tepla, 1990）。很棒的主意，可惜它不起作用，第一次的嘗試就可以證明這一點(diǎn)。為了形成液滴，最少需要5μl高濃度的冷凍液，這與取得適當(dāng)?shù)慕禍厮俾蔬€差很遠(yuǎn)。另外，一旦液滴到達(dá)液氮表面時(shí)會(huì)開(kāi)始漂浮并且會(huì)在水面上維持長(zhǎng)達(dá)數(shù)秒的無(wú)規(guī)則的游動(dòng)。原因很簡(jiǎn)單：液氮在零下196℃達(dá)到沸點(diǎn)。任何溫度較高的東西，如我們的液滴和樣品都會(huì)引起液氮的大量蒸發(fā)，產(chǎn)生的蒸汽層就像一個(gè)很好的隔熱層，能夠阻止液滴下沉，這樣的操作的結(jié)果甚至于測(cè)量不到的冷卻速率，可以說(shuō)是慘不忍睹的?；谶@個(gè)三重缺陷的方法的論文被重復(fù)發(fā)表了10年之久。

另一種途徑是液滴最小化法（Arav, 1992），這是一種明顯改進(jìn)并值得注意的方法。但是這個(gè)方法需要昂貴的低溫顯微鏡，無(wú)法用于日常實(shí)踐。

最終電鏡銅網(wǎng)作為載體開(kāi)始被應(yīng)用，這是一個(gè)有著巨大潛力的方法，是第一個(gè)充分利用小液體量并使用了直接接觸的方式（Martino et al, 1996）；事實(shí)上這也是迄今為止最好的解決方案之一。盡管對(duì)液體體積的標(biāo)準(zhǔn)化和一致性依然是個(gè)問(wèn)題，但少量的液體。導(dǎo)熱金屬增加了冷卻和復(fù)溫速率，快速固化的液膜使樣品安全地放在表面上，加熱后取出也很容易和安全。這種小金屬網(wǎng)改變了游戲規(guī)則，為降低低溫保護(hù)劑濃度和開(kāi)發(fā)小體積直接接觸方法的實(shí)用價(jià)值開(kāi)辟了道路。

然而，由于載體微小，缺乏正確識(shí)別和實(shí)際存儲(chǔ)的解決方案，限制了其在實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

我們必須明白：胚胎學(xué)家更喜歡使用麥管工作。胚胎實(shí)驗(yàn)室里的所有東西，或者幾乎任何樣本如：早期胚胎、囊胚、精子、卵母細(xì)胞（其中只有一小部分在以往的存貯方法中存活）都是低溫存貯在麥管里的。所有的杜瓦罐和其它液氮容器也都是為麥管存貯而設(shè)計(jì)的。他們不想為了進(jìn)入一個(gè)新領(lǐng)域的挑戰(zhàn)而放棄整個(gè)基礎(chǔ)設(shè)施。

因此，如果他們想要麥管，我們就提供經(jīng)適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)后的麥管給他們。這就是第一個(gè)專(zhuān)門(mén)為達(dá)到少液體量和高降溫/復(fù)溫速率目的而設(shè)計(jì)的玻璃化載體——敞開(kāi)式拉管OPS（ Vajta et al., 1998）。

好處是顯而易見(jiàn)的。易于操作，它就像是一支筆。通過(guò)液滴和毛細(xì)作用，使用極少量的液體輕松加載。由于樣品一直懸浮在液柱中，因此不會(huì)附著在表面上，也不會(huì)變形。液柱和管狀結(jié)構(gòu)也防止了加載后滲透壓變化帶的風(fēng)險(xiǎn)。在有著相對(duì)堅(jiān)固和安全的構(gòu)造的前提下，OPS的降溫和升溫的速度還是達(dá)到了要求。在降低了保護(hù)劑的濃度的同時(shí)取得了包括人類(lèi)在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物的胚胎和卵母細(xì)胞的高存活率，容易存儲(chǔ)在液氮罐中，利用管內(nèi)受熱膨脹的空氣自動(dòng)排出樣本，在解凍皿中輕松地復(fù)蘇樣本。

根據(jù)我個(gè)人的看法，對(duì)一個(gè)初學(xué)的胚胎學(xué)家而言，學(xué)習(xí)和持續(xù)使用OPS在學(xué)習(xí)和使用在比過(guò)去22年中其它任何設(shè)計(jì)或商業(yè)化的高速率玻璃化冷凍載體都要簡(jiǎn)單。更重要的是，在OPS之后引入的方法都不能提供更好的存活率、更一致的結(jié)果或更廣泛的適用性。The original is the best.

這或許只是純粹的運(yùn)氣，但事實(shí)的確如此。

當(dāng)然還有其它選擇，比想象的還要多。據(jù)估計(jì)，目前至少有100種高速率玻璃化方法。有好幾年，幾乎所有與玻璃化冷凍打交道的人都通過(guò)細(xì)微的改變建立自己的玻璃化裝置和方法，更不用說(shuō)個(gè)人因素。創(chuàng)造只是問(wèn)題的一部分，第二項(xiàng)任務(wù)也許更具挑戰(zhàn)性，就是命名?！癈ryo”和“Vitri”絕對(duì)是用得最多的，后面接上不同的后綴，如“l(fā)eaf、top、lock、tip、safe、inga”等，其中也包括用玻璃微管（請(qǐng)注意有些國(guó)家使用玻璃進(jìn)行低溫存貯是不合法的）改造的OPS、膠質(zhì)上樣吸頭、密封式拉抻麥管（CPS）、無(wú)菌剝卵管、移液吸頭；這僅僅是一小部分例子。

哪一個(gè)是贏家？

如果我們從數(shù)量上看，贏家是那些有強(qiáng)大商業(yè)背景支持的。如果我們從科學(xué)認(rèn)知角度上看，情況就不一樣了。關(guān)于OPS的原始描述的文獻(xiàn)（Vajta et al., 1998）仍然是玻璃化領(lǐng)域中被引用得最多的。這個(gè)方法廣泛應(yīng)用于和玻璃化相關(guān)實(shí)驗(yàn)和家畜胚胎學(xué)中, 世界上幾乎所有的冷凍保存后胚胎誕生的克隆動(dòng)物都是使用OPS方法。如之前所述，一種后來(lái)改變了整個(gè)人類(lèi)輔助生殖嘗試：首例通過(guò)玻璃化存貯的人類(lèi)卵母細(xì)胞誕生的嬰兒是通過(guò)使用了OPS方法，OPS仍然是人類(lèi)胚胎干細(xì)胞玻璃化最有效的方法。

    雖然 OPS的商業(yè)化被推遲了，但如今韋拓生物生產(chǎn)的敞開(kāi)式玻化凍存管（OPS）相繼獲得美國(guó)FDA認(rèn)證和中國(guó)醫(yī)療器械注冊(cè)證并陸續(xù)開(kāi)展全球銷(xiāo)售。我完全相信，在未來(lái)幾年內(nèi)，OPS將成為中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最受歡迎的人類(lèi)胚胎和卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)之一。

當(dāng)然，這只是開(kāi)始。

參考閱讀：

1. Vajta G. Vitrification in ART: past, present, and future. Theriogenology 2020 (in press).

2. Vajta G. Vitrification in human and domestic animal embryology: work in progress. Reproduction, Fertility and Development 2013; 25:719-727.